单剂量裸盖菇素，这种能急性引起时空感知扭曲和自我消融的致幻剂，在人体临床试验中产生了快速且持久的治疗效果。在动物模型中，裸盖菇素在大脑皮层和海马体中诱导神经可塑性。然而，人类大脑网络的变化如何与致幻剂的主观和持久效果相关仍不清楚。在这项研究中，我们通过纵向精确功能映射（每位参与者大约进行18次磁共振成像访问）追踪了个体特异性的大脑变化。健康成年人在高剂量裸盖菇素（25毫克）和哌甲酯（40毫克）使用前、使用期间以及使用后3周内接受了跟踪，并在6-12个月后再次接受了额外的裸盖菇素剂量。裸盖菇素极大地扰乱了大脑皮层和皮层下区域的功能连接（FC），其急性影响比哌甲酯造成的变化大3倍以上。这些FC变化是由大脑在不同空间尺度（局部、全局）上的去同步化驱动的，通过减少网络内部的相关性和网络间的反相关性，消解了网络间的区别。裸盖菇素引起的FC变化在默认模式网络中最为显著，该网络与前海马体相连，被认为是形成我们对空间、时间和自我感知的基础。个体间FC变化的差异与主观致幻体验强烈相关。执行知觉任务可以减少裸盖菇素引起的FC变化。裸盖菇素导致前海马体和默认模式网络之间的FC持续减弱，这种效应可持续数周。海马体-默认模式网络连接的持续减弱可能代表了致幻剂促进神经可塑性和治疗效果的神经解剖学和机制相关物。本文发表在Nature杂志。

正文：

      致幻药物通过激动5-HT2A受体可靠地诱导自我、时间和空间感知的强烈急性变化。在临床试验中，单次高剂量裸盖菇素（25毫克）已经证明可以快速且持续地缓解抑郁症、成瘾和临终焦虑的症状。综合这些观察结果表明，致幻剂应该诱导强烈的急性（持续约6小时）和持续性（24小时至21天）神经生物学变化。

     在啮齿动物模型中，致幻剂对5-HT2A受体的短暂激活可以改变5-HT2A丰富区域（例如内侧前额叶）的神经元通信，并诱导持续的可塑性相关现象。内侧前额叶和前海马体的突触生成被认为是裸盖菇素神经营养性抗抑郁作用的关键。然而，啮齿动物模型的固有局限性和与人类5-HT2A受体的不完全同源性限制了这些断言的普遍适用性。

      理解致幻剂对人类大脑网络的影响对于揭示其治疗机制至关重要。在人类中，在约6小时的作用持续时间内，裸盖菇素增加谷氨酸信号传导和葡萄糖代谢，广泛降低电生理信号的功率，减少血流动力学波动，并降低功能网络间的隔离。这些急性变化的驱动因素目前理解不足，特别是在皮层下区域。初步努力识别裸盖菇素使用后数周内的网络变化已产生了不一致的结果。裸盖菇素对临床相关回路的持续影响在人类中尚未得到表征。

     腹内侧前额叶皮层以及前部和中部海马体在功能上与默认模式网络（DMN）相连。海马体与DMN之间功能连接的增加与抑郁症状有关，而功能连接的减少则与治疗相关。这些5-HT2A受体丰富且与抑郁相关的默认模式区域是介导致幻剂神经营养性抗抑郁作用的候选区域。

     精确功能映射使用密集重复的功能磁共振成像（fMRI）采样来揭示个体特异性干预驱动的大脑变化的时间进程。这种方法考虑了大脑网络的个体间变异性，并利用了个体内网络从日复一日的高度稳定性。使用精确功能映射，我们观察到单次高剂量裸盖菇素后的个体特异性急性和持续性大脑变化。

     健康年轻成年人以1-2周间隔接受了25毫克裸盖菇素和40毫克哌甲酯（MTP，通用名利他林，剂量匹配以产生相似的唤醒效果），并在两次药物剂量之前、期间、之间和之后进行定期MRI扫描（每位参与者约18次）（扩展数据图1，补充表1和补充视频1：129次MRI访问的数据质量指标）。密集的用药前采样使参与者熟悉扫描仪并建立基线变异性。

裸盖菇素扰乱大脑连接

      裸盖菇素急性引起了大脑功能连接（FC）的深刻和广泛变化（图1a），遍及大脑皮层的大部分区域（P < 0.05，基于双侧线性混合效应（LME）模型和置换检验），但在联合网络中最为显著（FC变化均值（标准差，s.d.）：联合皮层0.44（0.03），初级皮层0.36（0.05））。在皮层下，最大的裸盖菇素相关FC变化出现在与DMN相连的丘脑、基底神经节、小脑和海马体部分（图1a和扩展数据图2）。在海马体中，强烈FC扰动的焦点位于前海马体（蒙特利尔神经学研究所坐标−24, −22, −16和24, −18, −16）。其他较大的FC扰动出现在背内侧和室旁丘脑以及前内侧尾状核。在小脑中，最大的FC变化出现在与DMN相连的区域（图1a）。

图1：裸盖菇素对功能性大脑组织的急性影响

      功能连接(FC)变化(欧几里得距离)在大脑皮层和皮层下结构中计算。药物条件的效应通过线性混合效应(LME)模型在6名纵向采样的参与者中进行了测试,包括10次裸盖菇素会话和6次哌甲酯(MTP)会话(a和b的阈值设为P < 0.05,基于带TFCE的置换测试;见扩展数据图2中的未阈值统计图)。

      a, 与裸盖菇素相关的FC变化,包括皮层下区域。a,前;p,后;L,左;R,右。   

     b, 与MTP（哌甲酯）相关的FC变化。

     c, 作为药物条件对照的典型每日间变异性(未阈值:未包含在LME模型中)。

     d, 个体定义网络中的平均FC变化。空心圆代表个体参与者。DMN的FC变化大于其他网络。基于旋转的零模型(自旋测试):10次裸盖菇素剂量,1000次置换,单侧Pspin < 0.001,(所有其他网络Pspin > 0.05)。**P < 0.001,未校正。

     e, 所有条件下静息扫描的全脑FC变化(与基线的欧几里得距离)。MT（哌甲酯）P、裸盖菇素和日间的FC变化与同一参与者的基线相比较。白点表示中位数,垂直线表示四分位数。预测全脑FC变化的LME模型:10次裸盖菇素剂量(275次观察),估计值(95% CI) = 15.83 (13.50, 18.15), t(266) = 13.39, P = 1.36 × 10−31,未校正。完整的FC距离矩阵及会话标签见扩展数据图3。

     f,g, FC变化差异与致幻体验差异的比较。f, 两个示例的个体FC变化图和MEQ30得分(所有药物会话见扩展数据图4)。g, 全脑FC变化与神秘体验评分之间的关系绘制了所有药物会话(裸盖菇素和MTP（哌甲酯）)。LME模型显示了显著关系:16次药物剂量(10次裸盖菇素,6次MTP),估计值(95% CI) = 69.78 (50.15, 89.41), t(13) = 7.68, P = 3.5 × 10−6,未校正。

      h, FC变化与MEQ30的关系(r2)映射到大脑皮层表面。

     相比之下,MTP（哌甲酯）相关的FC变化局限于感觉运动系统(图1b和扩展数据图2),并与每日间变异性图谱平行(图1c),可能是由于唤醒效应。裸盖菇素相关的FC变化在DMN中最大(图1d和补充图1;所有裸盖菇素会话的平均值;自旋测试,1000次置换,单侧Pspin < 0.001;所有其他网络Pspin > 0.05)。然而,MTP（哌甲酯）相关的FC变化在运动和行动网络中最大(Pspin = 0.002;所有其他网络Pspin > 0.05;补充图1b)。

      尽管MTP（哌甲酯）和裸盖菇素引起类似的心率增加(补充图2),但裸盖菇素对FC的影响比MTP的影响大三倍多(图1e;事后双侧t检验;P = 3.6 × 10−6,未校正)。裸盖菇素的效应也远远超过其他对照条件(图1e;日间变化(标准化)1;任务1.22,MTP 1.10,高头动1.29,裸盖菇素3.52,人与人之间3.53;扩展数据图3;这些效应对预处理选择具有稳健性:补充图3和4)。为了更好地理解裸盖菇素的影响,可以考虑药物引起的大脑组织平均变化与不同人之间大脑组织差异一样大(图1e)。

致幻体验

      在个体特异性成像模型下,每位参与者收集的大量数据使我们能够超越群体分析,并将主观致幻体验(30项神秘体验问卷,MEQ30)与每次会话的大脑功能数据进行比较(图1f)。MEQ30是一种自我评估工具,用于测量神秘体验的强度和质量,包括连接感、超越时空的感觉和敬畏感,最高分为150分(参考文献46)。在所有裸盖菇素会话和参与者中,FC变化与主观体验的强度相关(图1f和扩展数据图4)。将所有药物会话的全脑FC变化(x轴)与MEQ30得分(y轴)相关(图1g)显示r2 = 0.81(预测MEQ30得分的LME模型:FC变化的效应,t(13) = 7.68;P = 3.5 × 10−6,未校正)。头部运动与MEQ30得分无显著相关(帧间位移的效应,t(13) = −1.26,P = 0.23,未校正)。将个人神秘体验与相应FC变化之间的关系投射到大脑上(图1h,顶点级)显示,这种关系主要由联合皮层驱动,相对较少涉及初级运动和感觉区域。在MEQ30的四个维度(神秘、积极情绪、时空超越和难以言表)中,与大脑变化相关最强的是超越维度(例如,"失去通常的时间或空间感",r2 = 0.86,补充图5),然而,所有维度都高度相关(r > 0.8)。重复采样使我们能够确定,裸盖菇素在大脑中效应的个体间变异性更可能与药物效应的差异有关,而不是测量误差(参与者特异性对裸盖菇素反应的似然比检验,P = 0.00245,未校正)。

致幻维度

      为了检验大脑网络变化的潜在维度,我们对每次fMRI扫描的分区FC矩阵进行了多维缩放(MDS)。MDS对会话标签(例如,药物、参与者)是盲的。然而,解释最大变异量的维度1将裸盖菇素与其他扫描分开(图2a),除了一次会话,在该会话中参与者(P5R)在服用裸盖菇素30分钟后发生呕吐(图2a左侧的深红色点)。与裸盖菇素相关的维度1较高得分对应于DMN与其他通常与之反相关的网络(额顶叶、背侧注意、突显和行动模式)之间隔离的减少(图2b和扩展数据图5)。为了确定这是否反映了裸盖菇素在数据集和致幻剂中的共同效应,我们计算了接受静脉注射(i.v.)裸盖菇素和麦角酸二乙胺(LSD)的参与者现有数据集的维度1得分。在裸盖菇素和LSD数据集中,几乎每个参与者的维度1都因致幻剂治疗而增加(图2c),这表明这是跨致幻剂和个体的共同效应。

图2：大脑网络变异性的数据驱动聚类。

      使用对会话标签盲的MDS评估跨条件的大脑变化。

      a, 在散点图中,每个点代表单次15分钟扫描的全脑FC,基于扫描之间的相似性绘制在多维空间中。维度1和4显示了裸盖菇素的强烈效应。顶部显示基于药物条件编码的扫描。深红色表示参与者在服用裸盖菇素后不久发生呕吐。底部显示基于参与者身份着色的扫描。在大多数情况下,维度1将裸盖菇素与非药物和MTP（哌甲酯）扫描分开。维度1-4的权重矩阵见扩展数据图5。

     b, 维度1权重的可视化。前1%的边(连接)投射到大脑上(绿色表示裸盖菇素增加的连接)。虽然未显示结构,但包括了小脑连接。

      c, 在现有数据集中重新分析维度1,包括静脉注射裸盖菇素(左,参考文献55,维度1得分变化的配对双侧t检验,n = 9,t(8) = 2.97,P = 0.0177,未校正)和LSD(右,参考文献56,配对双侧t检验:n = 16,t(15) = 4.58,P = 3.63 × 10−4,未校正)。*P < 0.05,**P < 0.001,未校正。

      d, 裸盖菇素对网络FC的平均效应,分别显示网络内整合(左)和网络间隔离(右)。对于网络整合(左),蓝色表示同一网络内区域之间FC(相关性)的损失。对于网络隔离(右),蓝色表示与不同网络中所有其他区域的FC(反相关)损失;完整相关矩阵见扩展数据图6。功能性大脑组织的瓦解对应于网络内整合减少和网络间隔离减少。

      平均FC的减法（裸盖菇素减去基线）揭示了与维度1相似的FC变化模式（图2d和扩展数据图5和6）。与先前的致幻剂研究一致，裸盖菇素增加了网络之间的FC（特别是额顶叶、默认模式和背侧注意网络），而网络内的FC相对较少受影响。大脑网络之间隔离的类似损失模式也由笑气和氯胺酮产生，这表明这里观察到的致幻维度可能可以推广到类致幻解离药物。

      相比之下，MTP（哌甲酯）降低了感觉、运动和听觉区域的网络内FC（扩展数据图6），这与先前的报告一致，并类似于咖啡因的效果。为验证我们样本（n = 6）中的观察是否可推广，我们将我们研究中的兴奋剂效应与青少年大脑认知发展（ABCD）研究59中的效应进行了比较（n = 487服用兴奋剂）。ABCD中兴奋剂使用的效应与我们数据集中MTP相关的FC变化一致（扩展数据图6）。

去同步化解释FC变化

       多单元记录研究表明，致幻剂对5-HT2A受体的激动使通常共同激活的神经元群体去同步。我们提出，在更大的空间尺度上观察到的这种现象可能解释了与裸盖菇素相关的FC变化（图1）。我们观察到，静息态fMRI波动的通常稳定的空间结构被裸盖菇素破坏和去同步（补充视频2-7：每位参与者药物会话期间的大脑活动时间进程）。因此，我们使用归一化全局空间复杂度（NGSC）量化了大脑信号同步性：这是一种独立于信号数量的空间熵测量。NGSC计算后续时空模式解释的累积方差（图3a）。NGSC的最低值（0）意味着每个顶点和/或体素的时间进程完全相同。NGSC的最高值（等于1）意味着每个顶点和/或体素的时间进程是独立的，表示最大的去同步化（或空间熵）。

图3：裸盖菇素期间皮层活动的空间去同步化。

      a，NGSC捕捉大脑活动模式的复杂性。它源自解释底层结构所需的空间主成分数量。更高的熵等于去同步化活动。右侧是P6参与者裸盖菇素（红色）、MTP（蓝色）和无药物（灰色）条件下后续主成分解释的方差。

     b，单个参与者（P6）每次fMRI扫描的全脑熵（NGSC）。右侧显示所有参与者在裸盖菇素期间的增加。样本量在补充表1中提供。灰色条表示条件均值。

     c，功能脑区内的分区熵（在个体特异性分区上计算）显示与全脑熵类似的裸盖菇素驱动增加。

      d，与裸盖菇素相关的空间熵（个体特异性分区，跨参与者平均）在皮层表面可视化。裸盖菇素相关的熵增加在联合皮层最大。

      e，LSD相关的空间熵增加与裸盖菇素引起的类似（使用参考文献56的数据）。

      f，增加在空间上与5-HT2A受体密度相对应。在b-d中，n = 6参与者，272次观察（扫描）。对于e，n = 16参与者。

      裸盖菇素显著急性增加NGSC（全局空间复杂度），值在下一次会话前恢复到用药前基线（图3b,c）。NGSC的增加在全脑水平上观察到（图3b；LME模型，估计值（95%置信区间（CI））= 0.0510（0.0343，0.0676），t(265) = 6.8，P = 2.0 × 10−6，未校正），并与主观体验相关（MEQ30：扩展数据图7；r = 0.80，P = 3.52 × 10−4，未校正，在移除单个异常值后），而干扰变量则没有。对于个体定义的脑区62也观察到NGSC增加（图3c；LME模型，估计值（95% CI）= 0.0149（0.0071，0.0228），t(265) = 3.74，P = 2.30 × 10−4，未校正），联合皮层增加最大，初级皮层变化最小（图3d）。全局和局部去同步化在LSD数据集中得到复制（图3e），这些效应的分布与5-HT2A受体密度相关（图3f；NGSCpsilocybin与Cimbi-36结合的双变量相关，r = 0.39，P = 1.9 × 10−13；NGSCLSD与Cimbi-36结合，r = 0.32，P = 4.5 × 10−9，未校正）。

任务参与减少去同步化

       为研究任务状态如何影响裸盖菇素引起的大脑变化，要求参与者在扫描仪中完成一个简单的听觉-视觉匹配任务（方法，知觉fMRI任务）。参与者在药物会话期间以超过80%的准确率执行此任务（扩展数据图8a-c）。参与任务显著降低了与裸盖菇素相关的网络破坏和去同步化的幅度（图4；LME模型任务×裸盖菇素交互作用：FC变化P = 5.49 × 10−5，NGSC P = 4.82 × 10−8，未校正）。这些结果对扫描顺序效应（补充图6）和诱发反应回归（补充图7）具有稳健性。

图4：知觉任务表现对裸盖菇素相关FC变化和去同步化的影响。

      a，来自静息扫描（左）和任务扫描（右）的裸盖菇素相关FC变化。

      b，来自静息扫描（左）和任务扫描（右）的区域NGSC（全局空间复杂度）变化（裸盖菇素减去基线）。底部的条形图表示基线和药物条件下静息和任务期间相应的全脑FC变化（a）和全脑NGSC值（b）。LME模型表明任务×裸盖菇素对FC变化有交互作用（n = 7有裸盖菇素下的任务数据，估计值（95% CI）= −6.48（−9.59，−3.37），t(265) = −6.48，P = 5.49 × 10−5，未校正）以及任务×裸盖菇素对NGSC有交互作用（n = 7有裸盖菇素下的任务数据，估计值（95% CI）= −0.042（−0.056，−0.027），t(265) = −5.62，P = 4.82 × 10−8，未校正）。条形表示均值，误差条表示标准误。**P < 0.001，未校正。

      任务执行期间裸盖菇素驱动的大脑变化的减少似乎与"接地"的心理学原则相平行：将注意力转向外部作为缓解强烈或痛苦思想或情感的手段。接地技术常用于与致幻剂相关的心理治疗中，以减轻裸盖菇素的压倒性或痛苦效果。任务相关的网络去同步化减少为裸盖菇素对大脑活动和FC的上下文依赖效应提供了强有力的证据，并填补了前临床上下文依赖性研究和临床观察之间的重要空白。

      经典动物研究记录了致幻剂减少视网膜光刺激对视神经束的反应，间接减少视觉皮层激活。我们通过记录初级视觉皮层任务诱发反应的减少复制了这些效应（扩展数据图8d-g）。为评估裸盖菇素是否影响其他地方的血流动力学反应幅度，我们分析了知觉任务期间其他任务相关感兴趣区的诱发反应（扩展数据图8f,g）。但其他诱发反应的幅度并未因裸盖菇素而显著改变（药物和参与者的双因素方差分析；药物效应：左V1 P = 0.03，右V1 P = 0.02，所有其他P > 0.1，未校正）。

海马FC持续减少

      为评估致幻剂的持续神经营养和心理效应是否可能与裸盖菇素后持续的FC变化相关，我们比较了裸盖菇素后1-21天与裸盖菇素前的FC变化。全脑FC变化得分很小（标准化FC变化（范围）为1.05（0.94，1.27）），表明大脑的网络结构大多已恢复到基线水平（扩展数据图2）。

      非典型的皮层-海马连接性与情感症状有关，裸盖菇素后观察到海马神经发生。此外，裸盖菇素后海马谷氨酸的急性减少与DMN连接性减少和自我消融相关。因此，我们调查了显示强烈急性FC变化的前海马相同区域是否也显示持续的FC变化。我们在药物后3周期间观察到显著的FC变化（图5a,b；LME平均变化0.095，Ppre–post-psilocybin = 0.0033，未校正）。MTP后未观察到持续的FC差异（方法，"持续效应分析"部分；LME "FC变化" 90% CI（−0.056，0.080）；等价性δ = ±0.086，Ppre–post-MTP = 0.77）。

图5：裸盖菇素对海马-皮层功能连接（FC）的持续效应。

      a, 海马FC变化图（左海马；未阈值t图，如扩展数据图2所示）。上方显示急性裸盖菇素FC变化，下方显示持续FC变化（裸盖菇素后3周）。

     b, 每个点代表每位参与者在裸盖菇素使用前（左）和后（右）单次扫描的前海马FC变化得分（颜色如图2所示）。参与者在前海马显示裸盖菇素后FC变化增加（LME模型，裸盖菇素前与后比较；n = 6参与者，186次观察，估计值（95% CI）= 0.095（0.032, 0.168），t(182) = 2.97，P = 0.0033，未校正）。

     c, 来自前海马种子（蒙特利尔神经学研究所坐标−24, −22, −16和24, −18, −16）的连接性，显示裸盖菇素前（左）、裸盖菇素后（中）和持续变化（后减前）的示例参与者（P3）。最右侧大脑上的红色边界勾勒出个体特异性DMN。可以看到海马与DMN顶叶和额叶成分的FC减少。

      d, 所有参与者和扫描的前海马减去DMN的时间进程（参与者颜色如b所示）。黑色显示移动平均。

      e, 海马-皮层回路示意图。

      前海马与DMN之间的FC在裸盖菇素后减少（图5c,d）。将时间进程对齐使裸盖菇素剂量为第0天后的可视化表明，连接性在单次裸盖菇素剂量后减少3周（图5d；AntHip-DMN FC平均值（95% CI）：裸盖菇素前为0.180（0.169, 0.192）；裸盖菇素后为0.163（0.150, 0.176））。AntHip-DMN FC值在6-12个月后的重复访问时恢复到裸盖菇素前基线，然而，较小的重复样本（n = 4，每人一次裸盖菇素前访问）在统计上无法检测到小的变化。这一观察很引人注目，因为它定位于前海马，这是一个在裸盖菇素后显示显著突触生成的脑区。海马-皮层FC的减少可能反映了以自我为导向的海马回路可塑性的增加（图5e）。

从微观到宏观尺度的致幻效应

       静息状态下的同步共振模式被认为反映了大脑持续建模现实的任务。因此，功能网络组织在日、任务、MTP（哌甲酯）和唤醒水平（但不是个体之间）的稳定性反映了清醒意识的主观稳定性。相比之下，裸盖菇素引起的更大变化与参与者报告的意识根本改变的主观体验相符。与MTP（哌甲酯）效应相比，裸盖菇素效应的巨大幅度表明，观察到的变化不仅仅是由于唤醒增加或单胺能刺激的非特异性效应、。

       我们观察到致幻剂在区域和全局上去同步化大脑活动，这为神经科学微观和宏观尺度的先前发现之间提供了桥梁。多单元记录研究表明，致幻剂对5-HT2A受体的激动并不均匀地增加或减少锥体神经元的发放，而是使在典型条件下共同激活的神经元对或群体去同步。同时，先前的静息态fMRI研究报告了摄入裸盖菇素、相思藤和LSD后的一系列急性变化，这些变化广泛汇聚于网络连接性的丧失和全局整合的增加。在几个尺度上同步活动的破坏可能解释了致幻剂产生代谢活动增加、局部波动功率减少和大脑分离网络结构丧失的矛盾观察。这种神经活动的去同步化被描述为致幻状态下大脑活动熵或随机性的增加。我们的结果支持这些变化是致幻剂相关认知和知觉变化基础的假设。

去同步可能驱动持续性变化

       从典型的同步共激活模式的显著偏离可能是理解裸盖菇素急性效应及其持续神经营养效应的关键。静息活动的变化与裸盖菇素暴露期间谷氨酸依赖性信号传导的转变有关。这种现象由氯胺酮和致幻剂共享，它激活了体内平衡可塑性机制，这是对典型网络活动模式大幅偏离的神经生物学反应。这种对新奇性的反应包括BDNF、MTOR、EEF2和其他与可塑性相关的即刻早期基因表达的快速上调，这些基因被认为在抗抑郁反应中起关键作用。与这一观点一致，裸盖菇素在DMN中产生了最大的变化，DMN经常与神经精神疾病有关，同时在与自我和当下时刻相关的前部和中部海马区域也产生了显著变化。

       致幻剂在海马和皮层中快速诱导突触生成，这些效应似乎是动物模型中快速抗抑郁样效应所必需的。然而，理解致幻剂行为效应的基础需要人类研究。精确功能映射和个体水平表征的进展使我们能够识别静息态fMRI信号的去同步化，将这些变化与主观致幻效应联系起来，并将这些变化定位到与抑郁相关的回路（DMN，海马）。这些分析依赖于对个体基线大脑组织的精确表征（例如，大脑区域、网络和每日间变异性的个体定义），以了解干预如何改变该组织。这项精确药物机制研究是在非抑郁志愿者中进行的。验证裸盖菇素提出的抗抑郁机制将需要精确的患者研究。测量人脑中神经营养标志物的新方法将为细胞、大脑网络和心理水平的机制观察提供关键联系。