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摘要
单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为解析不同生物系统中的细胞异质性提供了独特视角。然而，由于技术限制，scRNA-seq数据存在较高的掉落率（dropout rate），导致大量数据丢失，从而对后续分析带来计算挑战。
本研究提出了一种基于图聚类自动编码器（GCAE）的新型缺失值填补方法——GraCEImpute，以应对scRNA-seq数据中的缺失数据问题。综合评估结果表明，GraCEImpute模型在准确填补scRNA-seq数据中的掉落零值方面优于现有方法。
此外，该模型在下游scRNA-seq数据分析中表现出显著提升，包括聚类分析、差异基因表达（DEG）分析和细胞轨迹推断。这些改进突显了GraCEImpute模型在scRNA-seq数据分析中的潜力，有助于更深入地理解细胞过程及其异质性。
引言
细胞是生命的基本构成单位，在单细胞和多细胞系统中展现出高度的功能多样性[1,2]。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的出现极大地促进了对细胞异质性的研究，使得科学家能够通过解析组织中的不同细胞类型和状态，获得前所未有的深刻见解[3,4]。scRNA-seq通过全转录组测序描绘细胞内外相互作用的整体图景，揭示复杂的细胞群体、基因调控网络及发育过程中的谱系轨迹[5,6]。此外，研究人员还利用scRNA-seq解析肿瘤免疫中的关键细胞相互作用，鉴定新生胸腺细胞群，并推动对造血及免疫应答的理解[7–9]。
然而，scRNA-seq的应用受到了技术局限的影响，例如高扩增偏倚（amplification bias）和低覆盖度（low coverage），主要由于mRNA在逆转录过程中丢失（即掉落事件，dropout events）[10–13]。如何处理scRNA-seq数据中的缺失值已成为当前研究的重点。AutoClass工具结合自动编码器（autoencoder）和分类器以增强信号保真度[14]。GE-Impute和IGSimpute利用基于图（graph-based）的模型进行数据插补[15,16]。MAGIC和SAVER采用信息扩散及信息借用技术来恢复数据[17]。DCA和scGMAAE通过先进的统计建模方法提高数据完整性和分析质量[18,19]。AGImpute使用动态阈值估计策略，并结合自动编码器和生成对抗网络（GAN）的混合深度学习模型来填补单细胞数据[20]。然而，现有方法往往忽略了细胞之间的复杂关系，而这些关系对于数据填补的准确性及下游分析至关重要。
自动编码器不仅广泛用于单细胞数据填补，还被应用于其他数据类型，如电子病历。Pereira等人[21]提出了一种基于变分自动编码器（VAE）的部分多重插补方法来补全医疗数据，并提高了下游分类任务的性能。Xu等人[22]开发了一种动态多模态变分自动编码器（dynamic multimodal variational autoencoder），可用于实验室检测、电子健康记录、盆腔超声检查及放射影像报告等多种数据类型，并利用不同模态之间的内在关联性进行缺失模态的填补。
近年来，研究人员尝试多种方法来建模细胞间关系，并分析其对细胞功能的影响。例如，Korn等人[23]和Yu等人[24]分别应用Prim算法和k近邻（KNN）算法研究细胞连通性及其功能影响。然而，目前针对细胞互联性的系统性研究仍然有限。
本研究提出了一种新的细胞关系建模方法，基于图聚类自动编码器（Graph Clustering AutoEncoder, GCAE）构建GraCEImpute框架，将自动编码器（AE）技术与聚类损失结合，以优化特征空间的表示，从而提升数据点的分布质量。GraCEImpute通过集成聚类与重构损失，实现聚类标签分配与特征学习的同步优化。其增强的聚类分析能力及局部结构保持能力，使GraCEImpute成为scRNA-seq研究领域的一项重要补充资源。
模型
GraCEImpute框架（图1）由三个核心模块组成：细胞图的综合表示和图聚类自动编码器。
各模块的详细介绍如下：
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细胞图的综合表示：该模块通过整合三种不同的图构建方法，合成最优的细胞-细胞交互图。综合细胞图能够捕捉细胞间的复杂关系，并为后续分析提供基础。
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图聚类自动编码器（GCAE）：GCAE利用图注意力网络（Graph Attention Network, GAT）学习每个节点的低维嵌入表示。这些嵌入表示用于通过解码器重构图的结构和特征矩阵。重构后的特征矩阵被插补回原始数据集，从而生成最终的填补数据集。
GraCEImpute框架基于上述三个核心模块，有效解决了scRNA-seq数据中的缺失值问题，并确保填补后的数据集适用于下游分析。
细胞-细胞连接分析
本研究采用综合方法推断细胞-细胞相互作用，并重构细胞相似性网络。具体步骤如下：
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K近邻（KNN）算法：首先，利用KNN算法计算细胞间的欧几里得距离，以构建邻接矩阵 [29]。
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图嵌入技术：其次，采用图嵌入技术，通过带偏随机游走（biased random walks）结合广度优先（BFS）和深度优先（DFS）采样策略，系统性地探索邻近细胞 [15]。
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Prim算法：最后，应用Prim算法构建最小生成树（MST），以最小化网络中所有连接的权重之和，确保细胞连接关系的最优表达 [23]。
本研究采用多数投票机制（majority-voting）来构建最终的邻接矩阵，每个计算出的邻接矩阵均等地贡献权重。具体而言，对于三种方法得到的邻接矩阵A₁、A₂和A₃，基于投票机制决定两细胞是否存在连接：
- 仅当两个邻接矩阵均显示两细胞间存在边连接时，最终邻接矩阵中才会保留该连接。
- 如果仅一个或没有邻接矩阵显示该连接，则最终邻接矩阵中不会存在该连接。
其中，在KNN方法中，K的默认值设定为5。该聚合技术确保最终的邻接矩阵融合了多种方法的不同视角，从而增强细胞-细胞连接表示的鲁棒性和可靠性。
图聚类自编码器
图聚类自编码器（Graph Clustering Autoencoder, GCAE）采用双组件结构（如图2所示）。
GCAE模型使用复合损失函数，由均方误差（MSE）损失和Kullback-Leibler（KL）散度损失两部分组成。其中，MSE损失来源于图自编码器（GAE），而KL散度损失用于衡量聚类分布之间的差异 [34]。
KL散度损失的定义如下：
GCAE模型的总损失函数是上述损失项的加权和，公式如下：
其中，Lmse 代表自编码器的重构损失，Lkl代表聚类损失，而 γ 是超参数，用于平衡两者的重要性。
训练与优化
本研究提出的 GraCEImpute 框架 采用 Python 3.9 版本，并基于 PyTorch 库实现。优化过程采用 Adam优化器，默认学习率为 0.0005。
GCAE的聚类损失计算基于模型隐藏层中的软分类（soft classification）。其中，GCAE部分使用 K-means 进行聚类标签预测，并默认聚类中心数量设定为 10。
早停机制（Early Stopping）
为防止过拟合，模型训练过程中采用早停机制（early stopping）。当满足以下任一条件时，训练停止：
- 训练达到预定义的最大迭代次数（epoch）。
- 训练损失在连续 5 轮迭代中变化小于 1e-4。
- 训练损失在 5 轮迭代内连续上升。
- 聚类模型的预测变动（delta_label）在两个连续迭代间小于 0.001。
其中，delta_label 用于衡量模型在相邻两个迭代周期中的聚类变化程度，计算公式如下：
其中，
- yi为当前迭代周期第 i个样本的聚类标签；
- zi 为前一迭代周期第 i个样本的聚类标签；
- N 为总样本数；
- Count(True)=1，Count(False)=0。
该度量方式可以有效监控模型收敛情况，并在聚类结果稳定时停止训练。
实验
这篇论文着眼于缺失值的插补上，利用细胞-细胞连接分析。