2021年5月IDT埃德特和先正达公司共同在《Frontiers in Genome Editing》杂志发表名为“Efficient Targeted Mutagenesis Mediated by CRISPR-Cas12a Ribonucleoprotein Complexes in Maize”的文章。文章报道了通过粒子轰击将Cas12a-gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)递送到未成熟玉米胚胎中，直接生成基因编辑品系的有效方法1。通过将Cas12a RNP递送到未成熟胚胎的再生过程，在不进行任何选择的情况下，以~7%的效率获得了基因编辑的品系。令人惊讶的是，当Cas12a RNP与含有PMI可选择标记基因的质粒共递送，以及用甘露糖筛选诱导产生的愈伤组织时，基因编辑效率平均提高到60%，在一些实验中高达100%。文章还表明，使用IDT埃德特自主研发的活性更高的Cas12a突变体可以在更难处理的靶序列上提高编辑效率。这些研究成果为玉米的遗传改良提供了有益的工具。

背景介绍

CRISPR-Cas基因编辑技术的发展使作物的定向诱变和精确基因替换成为可能。CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a是被广泛使用的两种主要基因编辑系统。然而，当使用转基因技术表达CRISPR-Cas12a编辑系统时，一些靶标在玉米和大豆等重要作物中遇到了编辑效率低的问题。文章测试了不同的Cas12a酶和递送方法的编辑效率，并报道了将Cas12a RNP递送至玉米叶原生质体和未成熟胚胎中可进行有效的基因编辑。当RNP通过粒子轰击递送时，通过与PMI标记基因的共选择，未成熟胚胎的平均编辑效率在60%以上。使用该方案产生的大部分突变体携带双等位基因突变，表明Cas12a RNP能有效地切割靶位点。文章还表明， 通过不具有共选择标记的RNP递送，也可以有效地生成具有遗传编辑的稳定品系，尽管效率会低很多。文章比较了不同版本的AsCas12a和LbCas12a蛋白，发现IDT埃德特自主研发的活性更高的Cas12a突变体AsCas12a-Ultra提高了对靶序列的编辑效率。

实验结果

01

将Cas12a RNP递送至玉米未成熟胚胎和叶原生质体中编辑染色体靶序列

通过递送CRISPR-Cas9 RNP成功进行基因编辑的研究已经在小麦和玉米未成熟胚胎中得到了证明2-3。然而, Cas12a RNP在玉米中的递送尚未建立。因此，文章研究了Cas12a RNP是否可以使用类似的粒子轰击技术在玉米中实现高效编辑。作者选择了两个基因区域作为目标：一个是Bx9基因的编码区域，该基因编码产生的UDP-glucosyltransferase参与DIMBOA的生物合成；另一个是与用于根虫防治的MIR604的转基因插入位点相对应的区域。

为了检测Cas12a-crRNA RNP复合体轰击未成熟胚胎后的突变情况，从轰击后培养2天的胚胎中提取基因组DNA并进行二代测序。用含有大于等于2bp的Indel的reads数除以覆盖gRNA目标区域的总reads数，计算带有编辑的reads百分比。表1显示了通过粒子轰击递送AsCas12a-Ultra RNP对靶序列的瞬时编辑结果。结果表明，利用AsCas12a RNP可以有效编辑Bx9TS2等基因靶标。由于在轰击过程中，只有一小部分胚胎细胞可以被微粒子轰击到，预计未成熟胚胎中最多有5-10%的细胞可以接收到Cas12a RNP。假设一个10天未成熟的玉米胚胎有大约1000个细胞，它最多有50-100个细胞可以接收到RNP复合体。假设编辑效率为50%，那么只有25-50个细胞会被编辑，也就是说，2.5-5.0%的序列会发生变异。值得注意的是，其中一种crRNA (crBx9GS2)产生了3.42%的带有编辑的reads，表明AsCas12a RNP已被递送到许多表面细胞，并且在编辑Bx9基因序列方面非常活跃 (表1)。

表1

文章还通过原生质体介导的转染，验证了在不成熟胚胎轰击实验中表现最好的crRNA (crBx9GS2和crMIR604GS2)的编辑效率(表2)。结果在两个目标上都实现了高效编辑，分别有20.45%和35.98%带有编辑的reads。与直接轰击胚胎相比，原生质体转染可以接收RNP的细胞比例要高得多，因此有望产生更高的编辑效率。然而，原生质体分离耗时且繁琐，而直接轰击未成熟胚胎操作简便，周期更短。

表2

02

Cas12a RNP与PMI可选标记基因载体共递送可获得高效编辑品系

由于在直接轰击未成熟胚胎中使用AsCas12a RNP实现了有效编辑，文章还测试了是否可以从以Bx9基因为靶点的RNP轰击的未成熟胚胎中获得稳定编辑的品系。我们将RNP与含有PMI可选择标记基因的质粒pBSC12672共递送，并比较了AsCas12a-WT和AsCas12a-Ultra的性能(表3)。根据Sanger测序结果, 使用AsCas12a-WT只有约1.2-7.1%的转基因植物显示对Bx9TS1目标的成功编辑 (表3)。值得注意的是,使用优化的AsCas12a核酸酶(AsCas12a-Ultra)可使编辑效率提高10倍，达到68.8%(表3)，表明AsCas12a-Ultra在玉米细胞中识别和切割基因目标序列方面具有很高的活性。

表3

03

不用选择标记，用Cas12a RNP轰击玉米未成熟胚胎可直接产生具有遗传编辑的品系

考虑到AsCas12a RNP直接轰击未成熟胚胎的高编辑率(表3)，文章研究了在没有选择标记的情况下，是否可以从靶向Bx9基因的RNP轰击的未成熟胚胎中获得稳定编辑的品系。将AsCas12a RNP递送到玉米未成熟胚胎后，1个月内获得再生株系(E0)。使用高通量Taqman assay4鉴定Bx9TS2靶序列中的突变体，突变体植物进一步通过测序来确认基因编辑。从表4中可以看出，从被轰击的419个未成熟胚胎中鉴定出24个Bx9TS2靶点突变体。NGS测序证实24个突变体中有18个具有双等位基因突变。

表4

04

与递送Cas12a DNA载体相比，递送Cas12a RNP具有相似或更高的编辑效率

玉米转基因通常采用粒子轰击或农杆菌介导。因此，转基因通常以DNA表达原件的形式递送。文章比较了递送Cas12a RNP和DNA两种方式的编辑效率。为了实现靶向Bx9TS1和Bx9TS2位点的Cas12a编辑系统的DNA递送，作者构建了含有不同AsCas12a和LbCas12a变体的载体，分别表达靶向Bx9TS1和Bx9TS2序列的crRNA。每个载体包含3个表达原件：PMI选择标记，Cas12a和crRNA，其两侧有自加工的核酸酶。

从表5的结果可以看出，Bx9TS2的编辑效率总体上高于Bx9TS1。有趣的是，与野生型AsCas12a蛋白(V3)相比，使用活性更高的突变体AsCas12a-Ultra，Bx9TS1的编辑效率显著提高。然而，野生型AsCas12a蛋白在Bx9TS2位点的编辑效率已经非常高，使用活性更高的突变体AsCas12a-Ultra对编辑效率的影响可以忽略不计(表5)。我们还比较了两种不同温度对Bx9TS1和Bx9TS2两个不同靶标编辑效率的影响。在28℃和33℃， AsCas12a和LbCas12a载体对两个靶标都有不错的编辑，而在33℃对两个靶标的编辑率更高(表5)。对于两种LbCas12a版本, LbCas12a- v3对两个靶位点的编辑率都要高于带有水稻优化密码子的LbCas12a (表5中的Lb, Qi)。值得一提的是，递送AsCas12a-Ultra RNP的方式对Bx9TS1靶序列的编辑率高于递送 Cas12a DNA载体的方式(表3,5)。

表5

总结

在作物中CRISPR-Cas12a是一种具有吸引力的基因编辑系统。在文章中作者证明了常用的玉米转基因目标外植体，即不成熟的胚胎可以被RNP直接轰击，以评估其基因编辑能力。另外，叶原生质体也可以作为一种有效的RNP筛选系统。文章还表明，当RNP递送到玉米未成熟胚胎时，可以实现高效编辑；此外，通过具有或不具有共选择标记的RNP递送，都可以有效地生成具有遗传编辑的稳定品系。最后，文章证明了AsCas12a, LbCas12a及其活性增强的突变体AsCas12a-Ultra都可以用于快速生成目标基因修饰的品系。文章所描述的技术为玉米这种重要的大田作物的精确基因编辑提供了有用的工具。

文章使用的Cas12a酶包括AsCas12a-WT, AsCas12a-V3, AsCas12a-Ultra和LbCas12a-V3和crRNA均由IDT埃德特提供。IDT埃德特自主研发的 Alt-R A.s. Cas12a Ultra 酶显著提高了整体编辑效率。Alt-R Cas12a Ultra 除了能识别TTTV基序外，还能识别许多TTTT PAM位点，增加了基因编辑研究的目标序列范围。此外， Alt-R Cas12a (Cpf1) Ultra 核酸酶在室温下亦具有活性，能够灵活满足较低温度下编辑应用的需求。

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gRNA（请搜索“泽平科技”进入咨询）

（gRNA可定制）

参考文献：

[1].Dong S, Qin YL, Vakulskas CA, Collingwood MA, Marand M, Rigoulot S, Zhu L, Jiang Y, Gu W, Fan C, Mangum A, Chen Z, Yarnall M, Zhong H, Elumalai S, Shi L and Que Q (2021) Efficient Targeted Mutagenesis Mediated by CRISPR-Cas12a Ribonucleoprotein Complexes in Maize. Front. Genome Ed. 3:670529. doi: 10.3389/fgeed.2021.670529

[2].Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J., and Cigan, A. M. (2016). Genome editing in maize directed by CRISPR–Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nat. Commun. 7:13274. doi: 10.1038/ncomms13274

[3].Liang, Z., Chen, K., Zhang, Y., Liu, J., Yin, K., Qiu, J. L., et al. (2018). Genome editing of bread wheat using biolistic delivery of CRISPR/Cas9 in vitro transcripts or ribonucleoproteins. Nat. Protocol. 13, 413–430. doi: 10.1038/nprot.2017.145

[4].Chen, Z., Kim, M., Chilton, M. D., Zhong, H., Gu, W., Jiang, Y., et al. (2018). Methods and Compositions for Identifying and Enriching for Cells Comprising Site Specific Genomic Modifications. United States Patent 9,963,710.