分子克隆之引物设计(一)
目的：
将目的基因Homosapiens interleukin 37利用引物扩增表达带上限制酶酶切位点，再与载体pcDNA3.1-3xFlag C酶切连接。
师兄给定的酶切位点是：(固定)：
BamH I (GGATCC)、
Xho I (CTCGAG)
目的基因：
各不相同，我的是
Homo sapiens interleukin 37
载体：(固定)
pcDNA3.1-3xFlag C
所使用软件：
| 数据库/软件 | 用途 |
| NCBI数据库 | 查询目的基因的CDS序列等 |
| Snapgene | 显示质粒图谱和酶切位点等 |
| primer premier 5.0 | 设计引物等 |
| oligo 6.0 | 对设计的引物进行评价等 |
其他：掌握基本的引物设计原则，置于部分软件从哪里找到，这就要靠大家的上网搜一搜啦！建议snapgene这个软件去官网下载试用版，免费使用一个月，师兄给的是一般版本的，很多功能是用不了的
基本过程
- 查找基因序列
- 限制性内切酶的选择
- 使用primer premier 5.0设计引物
- 使用oligo 6.0对设计的引物进行评价
Ps：很多知识点都是来源于网络的，感谢互联网上的朋友们！
一、查找基因序列
1、进入NCBI主页，下拉选框选择Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因，即Homo sapiens interleukin 37，点击搜索
2、在灵长类IL-37基因中选择需要的mRNA序列
3、点击进入，查看基因的相关信息
NM_014439.3为序列号
补充知识：
常用序列编号
一般来说，mRNA和基因组序列是我们主要的寻找对象。如果想找标准序列的话，mRNA用NM_开头的，基因组用NC_或者AC_开头的。
1. mRNA
NM_表示标准序列，为转录产物序列；成熟mRNA转录本序列。
XM_表示预测的蛋白编码序列；mRNA来自基因组注释，序列相当于基因组重叠群。大多数属于预测的。
NR_表示非编码的转录子序列，包括结构RNAs，假基因转子等。
2. 基因组
NC_完整的基因组分子序列，标记的类别包括基因组、染色体、细胞器、质粒。
AC_一些可供选择的注释的基因组序列，主要用来标记病毒和原核生物。
外显子区域
CDS区域
有一个小窍门，点击上图中的CDS区域，可以直接跳转到下图中的区域(自动棕红色显示CDS区域)
可见其编码序列为第43到699位碱基，继续往下拉，可见基因序列，选中编码序列(43-699)复制，打开primer premier 5.0
(起始密码子)ATG
atgtcctt tgtgggggag
61 aactcaggag tgaaaatgggctctgaggac tgggaaaaag atgaacccca gtgctgctta
121 gaagacccgg ctggaagccccctggaacca ggcccaagcc tccccaccat gaattttgtt
181 cacacaagtc caaaggtgaagaacttaaac ccgaagaaat tcagcattca tgaccaggat
241 cacaaagtac tggtcctggactctgggaat ctcatagcag ttccagataa aaactacata
301 cgcccagaga tcttctttgcattagcctca tccttgagct cagcctctgc ggagaaagga
361 agtccgattc tcctgggggtctctaaaggg gagttttgtc tctactgtga caaggataaa
421 ggacaaagtc atccatcccttcagctgaag aaggagaaac tgatgaagct ggctgcccaa
481 aaggaatcag cacgccggcccttcatcttt tatagggctc aggtgggctc ctggaacatg
541 ctggagtcgg cggctcaccccggatggttc atctgcacct cctgcaattg taatgagcct
601 gttggggtga cagataaatttgagaacagg aaacacattg aattttcatt tcaaccagtt
661 tgcaaagctg aaatgagccccagtgaggtc agcgattag
tag(UAG)为终止密码子，设计引物的时候需要将其删除，因为，真核表达载体上多含有标签序列，目的基因与载体链接后，在目的基因的下游即为标签序列，如果不去除上述终止密码子，则目的基因转录的时候就会在此终止，标签序列就不会得到表达，为后续筛选阻性克隆等实验带来困难！
二、限制性内切酶的选择与判定
使用snapgene软件，将所给的质粒序列导入软件，查看查看PcDNA3.1(+)载体图谱，选择合适的内切酶，筛选的标准是，目的基因序列内不存在该酶的酶切位点，以及选择实验室内常用的已有的酶。(其实snapgene也支持在线查找对应的质粒并显示图谱的，可以试试搜索
pcDNA3.1-3xFlag C)
1. snapgene中输入师兄给的载体序列，得到质粒图谱如下
上图和下图中也显示了双酶切位点BamH I(GGATCC)、Xho I(CTCGAG)
2. 在primer primer5软件中看看目的基因IL-37序列里面有无
BamH I(GGATCC)、Xho I(CTCGAG)的酶切位点
利用primer primer5软件，看看目的基因里面是否有这些酶的酶切位点，
如果有的话，就不可用给的限制酶了
点击Enzyme,将限制酶
BamH I(GGATCC)、
Xho I(CTCGAG)选入
结果棒棒哒，目的基因的序列里面没有限制酶的酶切位点。证明这两个限制酶可以用来构建载体
好嘞，做完这些前期工作，就可以开始正式的设计引物了！
以下属于废话
明日更新吧，搞不动了。每做一步操作都要截图，有些还要在图上标记文字。最关键的是，我对这个引物设计也不是很熟练啊啊啊啊啊！！！写推送要写到吐血了，word里面的图片不能直接复制到后台编辑，还要一个个另存为。。。。。